Biologie des communications volume 6, Numéro d'article : 646 (2023) Citer cet article
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La lutte chimique contre les moustiques vecteurs de maladies Aedes albopictus et Aedes aegypti est coûteuse, non durable et de plus en plus inefficace en raison de la propagation de la résistance aux insecticides. La technique de l'insecte stérile est une alternative intéressante, mais elle est limitée par des méthodes de séparation des sexes lentes, sujettes aux erreurs et inutiles. Nous présentons ici quatre souches génétiques de sexage (deux pour chaque espèce d'Aedes) basées sur des marqueurs de fluorescence liés aux locus sexuels m et M, permettant l'isolement de mâles transgéniques. De plus, nous démontrons comment la combinaison de ces souches sexées permet la production de mâles non transgéniques. Dans une installation d’élevage de masse, 100 000 larves mâles de premier stade pourraient être triées en moins d’une heure et demie, avec une contamination femelle estimée entre 0,01 et 0,1 % sur une seule machine. Les analyses coût-efficacité ont révélé que l'utilisation de ces souches pourrait entraîner des économies importantes lors de la mise en place et de l'exploitation d'une installation d'élevage de masse. Ensemble, ces souches génétiques de sexage devraient permettre une intensification majeure des programmes de contrôle contre ces vecteurs importants.
Aedes aegypti et Aedes albopictus sont des espèces de moustiques envahissantes responsables de la transmission de nombreux agents pathogènes, notamment les virus de la dengue (DENV), du chikungunya (CHIKV), du Zika (ZIKV) et de la fièvre jaune (YFV)1,2. Poussés par le changement climatique et le commerce mondial, les deux vecteurs se propagent rapidement et on prévoit que 49 % de la population mondiale sera exposée au risque de maladies transmises par Aedes d'ici 2050 en l'absence de mesures de contrôle efficaces3,4.
La suppression des populations de moustiques par la lutte génétique est l’une des alternatives les plus efficaces, durables et respectueuses de l’environnement à l’utilisation d’insecticides. Elle repose sur des lâchers massifs répétés de moustiques mâles non piqueurs – soit stériles (la technique de l’insecte stérile, SIT5, et ses dérivés, dont pgSIT6), infectés par Wolbachia (la technique de l’insecte incompatible, IIT7,8,9), les deux10,11, ou porteur d’un transgène mortel (Release of Insects carry a Dominant Lethal, RIDL)12. Pour toutes ces interventions, une méthode efficace de séparation des sexes est requise. Actuellement, les moustiques Aedes sont sexés sur la base du dimorphisme naturel de la taille des pupes à l'aide d'un trieur Hoch, qui peut être entièrement manuel13,14 ou partiellement automatisé11. Cette méthode, qui nécessite une taille de nymphe homogène et donc des conditions d'élevage larvaire optimisées en termes de densité, souffre de taux de contamination femelles compris entre 0,8 et 1 % et d'une forte variabilité quotidienne et d'utilisateur à utilisateur15. Notamment, un trieur de pupes et d'adultes en plusieurs étapes a été récemment décrit, permettant une contamination de 1,13 × 10−7 % par les femelles9. Cependant, ce système, comme toutes les autres méthodes existantes, présente l'inconvénient de trier tardivement et de récupérer moins de la moitié des mâles élevés14, ce qui signifie que plus de 75 % du total des pupes sont élevées et nourries en vain.
Chez les moustiques Anopheles, des souches transgéniques de sexage génétique (GSS) permettant une séparation automatisée des sexes des jeunes larves ont été décrites16,17,18,19. Les marqueurs fluorescents affichent une expression spécifique au mâle, soit en utilisant des séquences régulatrices spécifiques au mâle, soit en liant les marqueurs au chromosome Y. Une souche de sexage d'Anopheles coluzzii est liée à l'X20, ce qui rend les femelles plus fluorescentes que les mâles. La séparation des sexes est réalisée à l’aide d’un dispositif d’analyse et de tri paramétrique d’objets complexes (COPAS), qui fonctionne comme un cytomètre en flux, triant les grosses particules en fonction de leur fluorescence. De plus, comme alternative à la libération de mâles transgéniques, un schéma de croisement générant des populations non transgéniques exclusivement masculines à l’aide de COPAS a été proposé21. Ce schéma nécessite une souche portant un marqueur de fluorescence sur le chromosome Y et une autre portant un marqueur de fluorescence sur le chromosome X. Le croisement de femelles non transgéniques (X−/X−) de la première souche avec des mâles transgéniques (X+/Y−) de la seconde donne une descendance composée de femelles transgéniques (X+/X−) et de femelles non transgéniques (X−/Y−). −) les mâles.
120 piggyBac random insertions (Fig. 1d). The best m-linked insertion line that we obtained showed a recombination frequency of 0.1%. Its transgenic cassette harboured a Cas9 transgene associated with a DsRed fluorescence marker and was flanked by lox sites. A Cas9 transgene being undesirable in a sexing strain, we excised it using CRE recombinase and replaced it with an eGFP transgene. This Ae. albopictus m-linked strain was termed Aal-m. Sequencing of the transposon’s flanking genomic sequence indicated that it had landed into a highly repeated region; hence, its exact genomic location could not be identified but matched several loci in 1q31 (see Methods and Supplementary Data 1). Both Ae. albopictus transgenic lines show a clear sex-separation pattern in COPAS analyses (Fig. 1c, d). All four lines were fluorescence-sorted and screened at each generation. In the Aaeg-M line, a single recombination event was visually recorded after 15 generations (>10,000 individuals screened in total). Consequently, we estimated that the Aaeg-M and Aaeg-m lines recombine at approximately 0.01%. In Aal-M, four recombinant individuals were observed in the tenth generation after successively screening a total of >50,000 individuals. These recombinations are likely to have arisen from a single event, suggesting that recombination is extremely rare in the Aal-M strain as well./p>$50,000 savings at 20 M males/week and above, Fig. 5e). In total, considering construction, equipment, diet and consumable costs, GSS is predicted to be the most economical option at all tested throughputs, while GSS-CS starts to be more economical compared to manual sorting of pupae from a 10 M males/week throughput (Fig. 5f). Moreover, the workload, the cost of which can only be estimated on a country-by-country basis, is reduced by 29–38% with GSS and 18–27% with GSS-CS (Fig. 5g). For all comparisons, including equipment cost, the most expensive option is the automated sorting of pupae, as the devices are expensive (e.g. $40k for the automated sorter from11, J. Bouyer) and the number of insects to be reared is high (Fig. 5b–g)./p>20,000 screened larvae), we later injected the repair donor plasmid (190 ng/µL) with 5 µM Scr7 and three plasmids expressing different gRNAs under the control of different AeU6 promoters (70 ng/µL each plasmid). This method gave significantly higher knock-in rates (25 GFP positive larvae out of about 4000 screened)./p>20,000 G1 larvae screened, a single transgenic male larva was found, raised to adulthood, and crossed to WT females. Its progeny was composed of 100% eGFP positive sons and 100% eGFP negative daughters, indicative of M linkage. We termed this Ae. aegypti M-linked strain Aaeg-M. Upon injection of 600 BgR9 eggs with the pX3 repair plasmid and a mixture of three plasmids expressing gRNAs (GTGGCATAGCGCCGTGTGGA[GGG], GTCTTAAATGAAAGAGGCG[AGG], GTATCATGCGTATTGCGAG[AGG], brackets indicate the PAM) under the control of three different U6 promoters (gRNA cloning vectors: Supplementary Data 4), 43 larvae with transient eGFP expression were recovered in G0. Resulting 20 males and 20 females were crossed en masse to adults of the opposite sex. 25 transgenic G1 larvae were obtained, 10 of which were males carrying an M-linked insertion, 4 were males carrying an m-linked insertion and 11 were females carrying an m-linked insertion. Proper insertion site in AAEL019619 was confirmed by PCR in all tested individuals, which revealed that in some of these mosquitoes the whole repair plasmid had integrated. From a single male devoid of the plasmid backbone, an Ae. aegypti m-linked strain named Aaeg-m was established and further characterized. Both Aaeg-M and Aaeg-m lines were backcrossed into a Brazilian (Bra) genetic background for 7 generations./p>700 individuals screened in each line until the sixth generation (Supplementary Table 3). Most other M-linked lines also showed 100% fluorescent males but contained additional, non-M-linked multiple insertions and were discarded. Based on line fitness and COPAS profiles, we selected a YFP line termed Aal-M for further work as an Ae. albopictus M-linked strain. Additional M-linked lines marked with OpIE2-GFP or Pub-DsRed showing no recombination to date, carrying a docking attP site for subsequent transgenesis, and representing additional GSSs are also being maintained to date but were not further characterized in detail./p>120 random piggyBac insertions. For this, we screened our existing collection of Ae. albopictus transgenic lines for m/M-linkage and constructed an additional library of piggyBac constructs expressing various fluorescence proteins (eGFP, mTurquoise2, YFP or DsRed) under the control of promoters showing distinct expression patterns (3xP3, OpIE2, Ae. aegypti PUb, Drosophila melanogaster actin5C). By performing multiplex injections of these piggyBac plasmids together, we obtained lines carrying up to six distinct insertions as indicated by their colours and patterns of fluorescence. Out of 40 independent founder transgenic individuals screened (most of which carrying multiple insertions), only two insertions appeared m-linked: one carried an OpIE2-mTurquoise2 marker gene with a recombination rate of about 3%, and the other, called m-albR9, carried a Cas9 transgene with a DsRed reporter gene and showed a recombination rate of 0.1%. We exploited the latter, in which transgenes are flanked by two lox sites adjacent to an attP docking site. We injected m-albR9 eggs with a plasmid encoding Cre recombinase to excise Cas9 and DsRed transgenes, as Cas9 is undesirable in a GSS. From successfully excised individuals, we established an m-linked attP docking line, mX1, carrying no further transgene. In a second step, an attB-containing plasmid carrying a PUb-eGFP marker cassette was integrated into the attP site. The m-linkage of this new strain was verified by crossing eGFP males to WT females and screening their offspring. The new Ae. albopictus m-linked line, named Aal-m was made hemi/homozygous and amplified./p>
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